操作步驟如下：
1.安瓿管或凍存管的準備
用圓底硼硅玻璃制品的安瓿管，或螺旋口的塑料凍存管。注意玻璃管不能有裂紋。將凍存管或安瓿管清洗干凈， 121℃下高壓滅菌15-20分鐘，備用。
 
2.保護劑的準備
保護劑種類要根據微生物類別選擇。配制保護劑時，應注意其濃度，一般采用10-20%甘油。
 
3.微生物保藏物的準備
微生物不同的生理狀態對存活幾率有影響，一般使用靜止期或成熟期培養物。
分裝時注意應在無菌條件下操作。
 
菌種的準備可采用下列幾種方法：
①刮取培養物斜面上的孢子或菌體，與保護劑混勻后加入凍存管內；
②接種液體培養基，振蕩培養后取菌懸液與保護劑混合分裝于凍存管內；
③將培養物在平皿培養，形成菌落后，用無菌打孔器從平板上切取一些大小均勻的小塊（直徑約5-10毫米），真菌取菌落邊緣的菌塊，與保護劑混勻后加入凍存管內；
④在小安瓿管中裝1.2-2毫升的瓊脂培養基，接種菌種，培養2-10天后，加入保護劑，待保藏。
 
4.預凍
預凍時一般冷凍速度控制在以每分鐘下降1℃為好、使樣品凍結到-35℃。
 
目前常用的有三種控溫方法：
①程序控溫降溫法，應用電子計算機程序控制降溫裝置，可以穩定連續降溫，能很好地控制降溫速率。
②分段降溫法：將菌體在不同溫級的冰箱或液氮罐口分段降溫冷卻，或懸掛于冰的氣霧中逐漸降溫。一般采用二步控溫，將安瓿管或塑料小管，先放-20℃至-40℃冰箱中1-2小時，然后取出放入液氮罐中快速冷凍。這樣冷凍速率大約每分鐘下降1-1.5℃。
③對耐低溫的微生物、可以直接放入氣相或液相氮中。
 
5.保藏
將安瓿管或塑料凍存管置于液氮罐中保藏。一般氣相中溫度為-150℃，液相中溫度為-196℃。
 
6.復蘇方法
從液氮罐中取出安瓿管或塑料凍存管，應立即放置在38℃-40℃水浴中快速復蘇并適當搖動。直到內部結冰全部溶解為止，一般約需50秒-100秒。開啟安瓿管或塑料凍存管，將內容物移至適宜的培養基上進行培養。