稱取
用準確度1/100的電子天平稱取培養基所需藥品。先根據配方計算出配制定量培養基所需各種成分藥品的量，然后用天平準確稱取。稱量時用稱量紙折疊成簸箕狀盛放藥品。
溶化
培養基放入燒杯或搪瓷缸中，慢慢加入少量所需水，邊加入邊用玻棒攪拌。如果培養基中不含有瓊脂，培養基不需要加熱；如果含有瓊脂，則需要用本生燈或電磁爐加熱煮沸，溶解后，再補齊所需水，并攪拌均勻（如圖3所示）。如果配制的培養基量很大，可用不銹鋼鍋加熱溶化，可先用溫水加熱并隨時攪動，防止焦化，如有焦化現象，配制的培養基就不能使用，要重新配制。 配制培養基時不可用銅或鐵的容器溶化，因銅或鐵制容器可能會使培養基中的銅和鐵的含量超標，影響實驗（培養基中銅含量大于0.3mg/L，細菌不宜生長，鐵含量超過0.14mg/L，妨礙細菌產毒素）。對容易發生反應，產生沉淀的藥品，要分開溶解，后加入培養基，如磷酸氫二鉀和硫酸鎂。
調pH
雖然培養基中含有緩沖物質成分，能使培養基的pH盡可能的保持在要求的范圍內，但是配出的培養基若不符合要求，就要進行調整。如果有已校準pH計，可用pH計，如果沒有，可用精密的pH試紙，再根據需要用1 mol/L氫氧化鈉或1mol/L鹽酸（微調可用0.1氫氧化鈉或0.1mol/L鹽酸）調制所需的pH。培基的pH一般為7.4～7.6，也有酸性或堿性的。用氫氧化鈉調整的需要高壓滅菌的培養基，在調整pH時要調至高出所需0.1個～0.2個單位，因用氫氧化鈉調整時，高壓滅菌后，培養基的pH要降低0.1~0.2。如培養基中含有碳酸鈣成分，可不pH。
過濾
配成的培養基，若無特別要求，可省略此步。若有沉淀或渾濁．需要澄清的．液體培養基可用油紙過濾。而固體培養基可用中間夾一薄層脫脂棉的雙層紗布過濾。如果過濾法還不能達到澄清的要求，則可用蛋清澄清法，即培養基加熱冷卻到50~60℃，裝入三角瓶內（不超過容量的二分之一），按1000mL加人1個～2個雞蛋的蛋清，用力搖晃3-5min，高壓蒸汽滅菌121℃、20min，取出趁熱過濾即可。
分裝
配制好的培養基根據不同的用途分裝在三角瓶、試管等容器中，分裝試管，如果試管量很大，可用自動分液器，如果試管量少，可用漏斗分裝。分裝量不超過容器容積的三分之二。三角瓶以不超過容積的二分之一為宜；瓊脂斜面以不超過試管長度的五分之一為宜，滅菌后，擺成的斜面為培養基量的三分之一，底層為三分之二的量為宜；半固體瓊脂分裝量為試管長度的三分之一；用來接種或保菌的高層瓊脂，分裝量為試管長度的四分之一或三分之一，用來接種厭氧菌的要達到三分之二；瓊脂平板，內徑為90mm的以13mL~15 mL為宜，內徑70mm的平板為8mL~10 mL，制成的瓊脂平板若表面水分較多，可將平板倒扣，放置在37℃培養箱內30min，干燥后再用。每批培養基應另外分裝一小玻璃瓶（約20mL）與該批培養基同時滅菌，為測定該批培養基最終pH。
滅菌
分裝好的培養基應立即進行滅菌。滅菌的方法種類如下：1.高壓蒸汽滅菌法大多耐熱培養基都可用此法，小量分裝時，用121℃，15min；滅菌量大時，用121℃，30min滅菌；含糖類的培養基只能113~115℃，15min滅菌，避免糖類遭破壞。2.煮沸滅菌法對含有不耐高溫物質的培養基，可使用此方法。3.過濾除菌以過濾的方法除菌，用無菌操作技術，定量加入培養基。血液、抗生素可用無菌操作技術抽取，加入冷卻到50℃左右的培養基中。培養基含有不耐熱的物質時，可用此法。對LST培養基進行滅菌時，有時發酵管內會有氣泡。為防止發酵管內產生氣泡，可以采取以下幾項措施：1. 小倒管浸滿培養基（不留氣泡）后再加入到盛LST的試管中。2.滅菌鍋關閉放氣閥前，將鍋內氣體排干凈。3.試管塞不要塞得太緊（使用硅膠塞的時候），勿使用橡皮塞。4不要過早打開滅菌鍋，要等滅菌鍋內氣壓和溫度都降到與室溫一致或相差不大時再打開滅菌鍋。如果以上情況都做到還有氣泡，可用水做培養基組的對照試驗，若培養基組有氣泡，而對照組沒有氣泡可確定是培養基自身的原因。
倒平板
滅菌融化的培養基冷卻到50℃后，倒入無菌干燥的培養皿中。培養基的溫度不能過高，否則容易在培養皿的內蓋上形成太多的冷凝水；溫度太低，培養基又容易凝固成塊，無法制成平板。倒平板時，應在靠近酒精燈火焰進行，以免外界的雜菌落入平板內，左手拿培養皿，右手拿三角瓶的底部，用左手的小指和手掌部位把三角瓶的棉塞拔下，灼燒瓶口，用大拇指和食指把培養皿蓋打開一條縫，至瓶口剛好伸入，倒入培養基，以鋪滿底為限，不超過培養皿高度的三分之一，迅速蓋好蓋，放在桌面上，輕輕地轉動培養皿，使培養基分布均勻，冷凝后即可。
擺斜面
裝在試管中的瓊脂培養基，在滅菌完成后，趁熱立即擺放在木棒（或玻璃棒）上，并成適當的斜度，冷卻后，瓊脂凝固即成斜面。斜面長度不用超過試管二分之一。
質量檢查
培養基滅菌后仔細檢查一遍，發現有破裂、水分浸入、色澤異常、棉塞被培養基沾染，都要丟棄，不能再用。并測定其最終pH。還需進行無菌檢查和效果檢查。無菌檢查是將滅菌后的培養基取1管（瓶）~2管（瓶），37℃恒溫培養1d～2d，確定無雜菌生長；效果檢查是用標準菌株接種在相關的培養基上檢查檢查菌的生長、形態及生化情況，與已知情況相符。兩種情況都合格，配制的培養基方可使用。
